Complementary DNA

การแสดงผลของ cDNA microarray

ในพันธุศาสตร์ complementary DNA หรือ cDNA คือ ดีเอ็นเอที่ถูกสังเคราะห์ขึ้นโดยใช้เอ็มอาร์เอ็นเอ (mRNA) เป็นต้นแบบโดยอาศัยเอนไซม์ reverse transcriptase และ DNA polymerase cDNA มักใช้สำหรับ clone ยีนของยูคาริโอตเข้าไปในโปรคาริโอต เมื่อนักวิทยาศาสตร์ต้องการให้มีการแสดงออกของโปรตีนที่ปกติจะไม่มีการแสดงในเซลล์นั้น พวกเขาสามารถนำ cDNA เข้าไปยังเซลล์ตัวรับ (recipient cell) ซึ่งจะทำให้เซลล์สามารถให้ (code) โปรตีนชนิดนั้นได้ นอกจากนี้ cDNA ยังสามารถสร้างขึ้นโดย retrovirus เช่น HIV-1, HIV-2, Simian Immunodeficiency Virus ซึ่งสามารถเข้าไปแทรกตัว (integrate) เข้าไปยัง host เพื่อสร้าง provirus อีกด้วย

ข้อมูลเบื้องต้น

สำหรับรายละเอียดของ Central dogma of molecular biology อย่างคร่าว ๆ ในการสังเคราะห์โปรตีน คือ ดีเอ็นเอจะถูกทรานสคริปชันเป็นอาร์เอ็นเอซึ่งจะถูกทรานสเลชันต่อไปเป็นโปรตีน สิ่งหนึ่งที่เป็นความแตกต่างกันระหว่างยูคาริโอตและโปรคาริโอต นั่นคือ ยีนของยูคาริโอตมี intron (intervening sequences) ซึ่งไม่ใช่ลำดับเบสที่จะถูกเปลี่ยนไปเป็นโปรตีนและจะถูกกำจัดออกไปก่อนที่จะเป็น mRNA แต่ยีนของโปรคาริโอตนั้นไม่มี intron ดังนั้น โปรคาริโอตจึงไม่มีกระบวนการ RNA splicing ในการกำจัด intron

บ่อยครั้งที่มีความต้องการให้มีการแสดงออกของยีนยูคาริโอตในเซลล์โปรคาริโอต ซึ่งวิธีอย่างง่ายนั้น คือ การนำดีเอ็นเอของยูคาริโอตเข้าไปในเซลล์ของโปรคาริโอตซึ่งดีเอ็นจะถูกทรานสคริปชันไปเป็นอาร์เอ็นเอซึ่งจะถูกทรานเลชันไปเป็นโปรตีนอีกที อย่างไรก็ตาม ดีเอ็นเอของยูคาริโอตนั้นมี intron แต่โปรคาริโอตไม่มีกลไกที่จะกำจัด intron เหล่านั้นได้ ดังนั้น intron เหล่านี้จึงต้องถูกกำจัดออกไปก่อนที่จะนำดีเอ็นเอของยูคาริโอตเข้าไปในโปรคาริโอตเซลล์ ซึ่งดีเอ็นเอชนิดนี้จะถูกสังเคราะห์ขึ้นจากอาร์เอ็นเอ เรียกว่า complementary DNA (cDNA) นั่นเอง

การสังเคราะห์

การสังเคราะห์ cDNA มีหลายวิธี แต่การสังเคราะห์ cDNA นั้น มักจะสังเคราะห์ขึ้นจาก mature mRNA (RNA ที่ intron ถูกตัดออกไปแล้ว) โดยใช้เอนไซม์ reverse transcriptase ซึ่งจะทำงานบนอาร์เอ็นเอสายเดี่ยว (single strand of mRNA) ในการสร้างสายดีเอ็นเอที่จำเพาะกับอาร์เอ็นเอนั้น (complementary DNA) โดยจะอาศัยการจับกันของเบสของอาร์เอ็นเอ (A, U, G และ C) กับเบสของดีเอ็นเอที่จับกันนั้น (T, A, C และ G ตามลำดับ) โดยมีหลักการคร่าว ๆ ดังนี้

1. ยูคาริโอตเซลล์จะถอดรหัสของยีนจากดีเอ็นเอไปเป็นอาร์เอ็นเอ (pre-mRNA)
2. pre-mRNA นั้นจะถูกกำจัด intron, เพิ่ม poly-A tail และ 5’ Methyl-Guanine cap หลังจากสิ้นสุดกระบวนการนี้จะเรียกว่า mature mRNA
3. mature mRNA จะถูกสกัดออกมาจากเซลล์
4. poly-T oligonucleotide primer จะจับกับ poly-A tail ของ mature mRNA ซึ่งใช้เป็นต้นแบบในการสังเคราะห์ cDNA หรือ อาจจะใช้ random hexamer primer ซึ่งสามารถจับกับ RNA ได้เช่นกัน
5. เติม Reverse transcriptase ร่วมกับ deoxynucleoside triphosphate (A, T, G, C) ขั้นตอนนี้จะสังเคราะห์ดีเอ็นเอหนึ่งสายโดยใช้ mRNA เป็นต้นแบบ (DNA-RNA hybrid strand)
6. ในการสร้างสายดีเอ็นเออีกสายเพื่อสร้าง double strand DNA (dsDNA) ต้องทำการย่อยสาย RNA ที่จับกับดีเอ็น (DNA-RNA hybrid) ในขั้นตอนก่อนหน้าโดยใช้เอนไซม์ เช่น RNase A
7. หลังจากย่อยสายอาร์อ็นเอแล้ว ดีเอ็นเอจะกลายเป็นสายเดี่ยว (single stranded cDNA:ss cDNA) ดีเอ็นเอจะเปลี่ยนรูปร่างเป็น loop เนื่องจากภาวะ hydrophobic
8. จากการที่ ss cDNA มีลักษณะเป็น loop นั้นจึงสามารถใช้เป็นต้นแบบในการสร้างสายดีเอ็นเออีกเส้นโดยใช้ reverse transcriptase
9. เมื่อถึงขั้นตอนนี้จะได้ double stranded cDNA ซึ่งจะมีลำดับเบสที่เหมือนกับ mRNA ที่ต้องการ