การหาลำดับแบบไอออนเซมิคอนดักเตอร์

การหาลำดับแบบไอออนเซมิคอนดักเตอร์ เป็นวิธีการหาลำดับดีเอ็นเอ โดยอาศัยการตรวจจับไอออนไฮโดรเจน(H+)ที่ถูกปล่อยออกมา ในระหว่างที่เกิดปฏิกิริยาพอลิเมอร์ไรเซชัน (Polymerization) ของ DNA วิธีการนี้จะเรียกว่า "การหาลำดับโดยการสังเคราะห์" ซึ่งเกิดในระหว่างการสร้างดีเอ็นเอสายใหม่(complementary strand) โดยจะอาศัยลำดับของสายเทมเพลต (template strand)เป็นแม่แบบ

หลุมขนาดเล็ก (Microwell) ที่มีสายดีเอ็นเอแม่แบบอยู่จะถูกหาลำดับโดยการเติมดีออกซีไรโบนิวคลีโอไทด์ไตรฟอสเฟต (dNTP) เพียงชนิดเดียวในแต่ละรอบ ถ้า dNTP นั้นเกิดการเข้าคู่สมกับนิวคลีโอไทด์ในเทมเพลต ก็จะเกิดการสร้างสายใหม่ที่เป็นคู่สมกับดีเอ็นเอแม่แบบขึ้น เป็นเหตุให้มีการหลั่งไฮโดรเจนไอออน(H+)ออกมาแล้วถูกไอออนเซ็นเซอร์ ISFET ตรวจจับได้ ซึ่งบ่งชี้ว่าเกิดปฏิกิริยาพอลิเมอร์ไรเซชันขึ้น ถ้าเกิดว่าในสายดีเอ็นเอแม่แบบมีเบสที่เป็นชนิดเดียวกันซ้ำกันเยอะๆ ก็จะเกิดการนำ dNTP มาต่อสายที่มากกว่าหนึ่งตัวในหนึ่งรอบส่งผลให้เกิดการปล่อยไฮโดรเจนจำนวนมากและเกิดสัญญาณมากกว่าปกติ

เทคโนโลยีนี้จะแตกต่างจากเทคโนโลยีการหาลำดับโดยการสังเคราะห์อื่น ๆ โดยวิธีนี้จะไม่มีการใช้นิวคลีโอไทด์ที่ถูกดัดแปลง หรือเลนส์ (optics)  วิธีการหาลำดับแบบไอออนเซมิคอนดักเตอร์ อาจจะถูกเรียกว่า Ion Torrent sequencing, pH-mediated sequencing, silicon sequencing, หรือ semiconductor sequencing

ประวัติการพัฒนาเทคโนโลยี

เทคโนโลยี ดังกล่าว ได้รับใบอนุญาตจาก DNA Electronics Ltd ซึ่งถูกพัฒนามาจากระบบ Ion Torrent และถูกเผยแพร่ในเดือนกุมภาพันธ์ 2010  ซึ่งระบบ Ion Torrent มีการทำการตลาดเครื่องจักรที่เกิดขึ้นอย่างรวดเร็ว เนื่องจากระบบ Ion Torrent มีความกะทัดรัดและประหยัด ซึ่งสามารถนำไปใช้ในห้องปฏิบัติการจำนวนมากได้ ในลักษณะที่เป็นเครื่องตั้งโต๊ะ บริษัท 454 Life Sciences ของโรช ได้ร่วมมือกับ DNA Electronics ในการพัฒนาความสามารถในการอ่านให้สามารถอ่านลำดับได้ยาวขึ้น โดยมีการนำรูปแบบการหาลำดับที่มีการเพิ่มเซมิคอนดักเตอร์ให้หนาแน่นมากขึ้นมาใช้เทคโนโลยีนี้

เทคโนโลยี

ในธรรมชาติ การเข้าคู่สมระหว่าง dNTP กับสายดีเอ็นเอแม่แบบในการสร้างสายดีเอ็นเอ จะเกิดการสร้างพันธะโควาเลนต์ และเกิดการปลดปล่อยไพโรฟอสเฟต (Pyrophosphate) และไฮโดรเจนไอออน(H+)ที่มีประจุบวกออกมา dNTP จะเกิดการเข้าคู่กับดีเอ็นเอเทมเพลตในกรณีที่เป็นคู่สมกันเท่านั้น การหาลำดับโดยวิธีไอออนเซมิคอนดักเตอร์จึงใช้ประโยชน์จากสิ่งที่ โดยพิจราณามีการปลดปล่อยไฮโดรเจนไอออน(H+) ออกมาหรือไม่เมื่อมีการให้ dNTP เข้าไปในปฏิกิริยา

หลุมขนาดเล็กบนแผ่นชิปเซมิคอนดักเตอร์จะมีโมเลกุลของดีเอ็นเอแม่แบบสายเดี่ยวจำนวนมากที่จะถูกหาลำดับอยู่ จากนั้นเอนไซม์ดีเอ็นเอโพลีเมอเรส จะนำเบส A, T, C หรือ G ซึ่งเป็น dNTP ต่างๆที่ไม่ได้ดัดแปลงเข้ามาต่อ ถ้า dNTP ที่นำเป็นเบสคู่สมกับสายดีเอ็นเอแม่แบบ ก็จะเกิดการต่อสายและสร้างสายดีเอ็นเอขึ้นมาได้โดยการทำงานของดีเอ็นเอพอลิเมอร์เรส แต่ถ้า dNTP ที่นำไม่ใช่คู่สมกับสายดีเอ็นเอแม่แบบก็จะไม่เกิดปฏิกิริยาทางชีวเคมี ไฮโดรเจนไอออน(H+)ที่ถูกปลดปล่อยออกมาในปฏิกิริยาจะไปเปลี่ยนแปลงค่าพีเอชของสารละลาย ซึ่งจะถูกตรวจพบโดยเซนเซอร์ ISFET  โมเลกุลของ dNTP ที่ไม่ได้จับเข้าคู่ก็จะถูกล้างออกไป ก่อนเริ่มปฏิกิริยาครั้งใหม่ซึ่งจะมีการให้ dNTP อีกชนิดเข้าไป

การตรวจจับสัญญาณ

ภายใต้ชั้นของ microwells ซึ่งเป็นชั้นที่มีความไวต่อไอออน และในด้านล่างของชั้นนี้จะเป็นเซ็นเซอร์ ISFET ion ตัวชั้นทั้งหมดจะถูกบรรจุไว้ใน CMOS semiconductor chip ซึ่งจะมีลักษณะคล้ายกับที่ใช้ในอุตสาหกรรมอิเล็กทรอนิกส์ โดยในแต่ละชิปมี array หรือชุดข้อมูล ของ microwells พร้อมกับเครื่องตรวจจับ ISFET ที่ทำงานสอดคล้องกัน โดยไฮโดรเจนไอออน(H+)ที่ถูกปล่อยออกมาแต่ละตัว จะถูกตรวจวัดด้วย ISFET ion sensor และเกิดการส่งสัญญาณคลื่นไฟฟ้าเป็นชุดๆจากชิปไปยังคอมพิวเตอร์และแปลเป็นลำดับ DNA  โดยไม่ต้องมีการแปลงเป็นสัญญาณระหว่างทาง  เพราะว่า ในการเกิดการเข้าคู่ของนิวคลีโอไทด์สามารถวัดได้โดยตรงจากอุปกรณ์อิเล็กทรอนิกส์ และในการวัดควรหลีกเลี่ยงการใช้นิวคลีโอไทด์ที่มีฉลากและการวัดด้วยแสง  ซึ่งการประมวลผลของสัญญาณและการประกอบ DNA สามารถดำเนินการในซอฟต์แวร์ได้

ลักษณะการหาลำดับ

ความแม่นยำพื้นฐานที่สามารถทำได้ในบ้าน โดย Ion Torrent ต่อลำดับ Ion Torrent Ion semiconductor ณ เดือนกุมภาพันธ์ ปี2554 พบว่าอยู่ที่ 99.6% จากการอ่านจำนวนเบส 50 ครั้ง ด้วย 100 Mb ต่อหนึ่งรอบ โดยมีความยาวการอ่าน 100 คู่เบส มีความแม่นยำในการหาลำดับที่มีเบสที่ซ้ำกัน 5 ซ้ำ คือ 98 % ต่อมาได้แสดงความยาวในการอ่านได้ 400 คู่เบส ซึ่งยังไม่มีการตรวจสอบจากบริษัทภายนอก

ข้อดี

ข้อดีที่สำคัญของวิธี ion semiconductor sequencing คือ การตรวจจับอย่างรวดเร็ว ขั้นตอนไม่ซับซ้อนและต้นทุนต่ำ โดยไม่มีการดัดแปลงนิวคลีโอไทด์และการวัดแสง

เนื่องจากระบบจะบันทึกเหตุการณ์การรวมตัวของนิวคลีโอไทด์ตามธรรมชาติโดยพอลิเมอเรส การหาลำดับสามารถเกิดขึ้นได้แบบเรียลไทม์ ซึ่งในความเป็นจริงการหาลำดับจะถูกจำกัดด้วยการไหลเวียนของนิวคลีโอไทด์ของสารตั้งต้นผ่านระบบ  โดยบริษัท Ion Torrent Systems Inc. ทางผู้พัฒนานั้นได้อ้างว่า การวัดการรวมตัวแต่ละครั้งจะใช้เวลา 4 วินาทีและรันแต่ละครั้งจะใช้เวลาประมาณ1 ชั่วโมง ระหว่างการหาลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ยาว 100-200 คู่เบส ซึ่งหากSemiconductor chipsได้ถูกพัฒนา(ตามการคาดการณ์จากกฎของมัวร์) จำนวนการอ่านต่อซิป(แต่ละการดำเนินการ)จะเพิ่มขึ้น

ค่าใช้จ่ายในการซื้อ pH-mediated sequencer จาก Ion Torrent Systems Inc. ในช่วงเปิดตัวมีราคาประมาณ $ 50000 USD ไม่รวมอุปกรณ์การเตรียมตัวอย่างและเซิร์ฟเวอร์สำหรับการวิเคราะห์ข้อมูล โดยค่าใช้จ่ายต่อการรันนั้นจะต่ำกว่าวิธีการAutomated sequencingอย่างมีนัยสำคัญด้วยค่าใช้จ่ายประมาณ $ 1000

ข้อจำกัด

ถ้ามีลำดับนิวคลีโอไทด์ที่มีการซ้ำกันของเบสที่เหมือนกันเป็นสายยาว (เช่น TTTTT) ปรากฏอยู่บนสายแม่แบบ(สายที่จะใช้หาลำดับ) ก็จะเกิดการต่อสายนิวคลีโอไทด์ที่มากกว่าหนึ่งตัวในหนึ่งรอบและไฮโดรเจนไอออน (H+ )จำนวนมากที่เกิดขึ้นจะถูกปลดปล่อยออกมาพร้อมกันในรอบเดียว ส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของค่าพีเอชที่สูงขึ้นและให้สัญญาณออกมามากกว่าปกติตามไปด้วย นี่เป็นข้อจำกัดของระบบที่ทำให้ยากที่จะระบุหรือหาลำดับของเบสที่ซ้ำกันยาวๆได้ โดยข้อจำกัดนี้ยังพบได้กับเทคนิคอื่นๆ ด้วย เช่น pyrosequencing สัญญาณที่สร้างจากจำนวนซ้ำที่สูงๆ นั้นยากที่จะแยกความแตกต่างจากการซ้ำที่คล้ายกันแต่จำนวนต่างกันได้ เช่น ลำดับที่มีเบสที่เหมือนกันซ้ำกัน 7 ซ้ำ ยากที่จะแยกความแตกต่างออกจากลำดับที่มีเบสที่ซ้ำกัน 8 ซ้ำ เป็นต้น

ข้อจำกัดอื่นของระบบนี้ คือ ความยาวในการอ่านสั้น เมื่อเทียบกับวิธีการหาลำดับอื่นๆ เช่น Sanger sequencing หรือ pyrosequencing การอ่านลำดับได้ที่ละยาวๆ จะเป็นประโยชน์สำหรับในการประกอบจีโนมขึ้นใหม่ เครื่องมือในการหาลำดับแบบ Ion Torrent semiconductor มีความยาวเฉลี่ยในการอ่านได้ประมาณ 400 นิวคลีโอไทด์ต่อหนึ่งครั้งของการอ่าน

ปริมาณในการหาลำดับนิวคลีโอไทด์ขณะนี้ยังต่ำกว่าเทคโนโลยีการหาลำดับอื่นๆ ที่มีความสามารถในการหาลำดับนิวคลีโอไทด์ในปริมาณที่มากกว่า แม้ว่าผู้พัฒนาหวังว่าจะสามารถเปลี่ยนแปลงสิ่งนี้ได้โดยการเพิ่มความหนาแน่นของชิป

การประยุกต์ใช้

นักพัฒนาของ Ion Torrent semiconductor sequencing ได้ทำการตลาดอย่างรวดเร็ว เป็นเครื่องหาลำดับที่มีขนาดกะทัดรัดและประหยัดที่สามารถใช้ได้ในจำนวนมากในห้องปฏิบัติแบบเป็นเครื่องตั้งโต๊ะ บริษัท หวังว่าระบบของพวกเขาจะใช้หาลำดับนอกพื้นที่เฉพาะไปจนถึงโรงพยาบาลและห้องปฏิบัติการขนาดเล็ก บทความจากหนังสือพิมพ์ New York Times ฉบับเดือนมกราคม 2554 เรื่อง "การหาลำดับดีเอ็นเอเพื่อมวลชน" เป็นการตอกย้ำความทะเยอทะยานนี้

เนื่องจากสามารถเป็นวิธีการทางเลือกหนึ่งที่ใช้ในการหาลำดับเพื่อให้ได้ความยาวการอ่านที่มากขึ้น (ดังนั้นจึงเหมาะสมกว่าการวิเคราะห์จีโนมทั้งหมด) เทคโนโลยีนี้อาจเหมาะสมที่สุดสำหรับการประยุกต์ใช้กับงานขนาดเล็ก เช่น การหาลำดับจีโนมของจุลินทรีย์ ,การหาลำดับทรานสคริปโตม(transcriptome)ของจุลินทรีย์ ,การหาลำดับเป้าหมาย ,การหาลำดับแอมพลิคอน(amplicon)หรือสำหรับการทดสอบคุณภาพของคลังลำดับต่างๆ