อาร์เอพีดี

การทดลองเทคนิคอาร์เอพีดี

อาร์เอพีดี (อังกฤษ: random amplification of polymorphic DNA, ย่อได้ว่า RAPD อาจอ่านได้ว่า "เรปิด" (rapid)) เป็นวิธีตรวจลายพิมพ์ดีเอ็นเอโดยใช้เทคนิคพีซีอาร์ แบบหนึ่งที่ไม่จำเป็นต้องทราบข้อมูลเกี่ยวกับลำดับเบสของดีเอ็นเอเป้าหมาย เนื่องจากไพรเมอร์ที่ใช้ไม่จำเพาะเจาะจงกับดีเอ็นเอบริเวณใด (arbitrary primer) วิธีการนี้มีการเรียกชื่อแบบอื่นได้อีก เช่น arbitrarily primed PCR (AP-PCR), DNA amplification fingerprinting (DAF) หรือ multiple arbitrary amplicon profiling (MAAP) ซึ่งแต่ละวิธีที่เรียกนี้มีข้อแตกต่างกันบ้าง คือ ขนาดของไพรเมอร์ที่ใช้ แต่หลักการไม่แตกต่างกัน คือ ใช้ไพรเมอร์ที่มีขนาดสั้นเพียงชนิดเดียวเพื่อเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอแบบสุ่ม มีนักวิจัยบางกลุ่มใช้ไพรเมอร์ 2 ชนิดพร้อมกัน ซึ่งก็ใช้ได้เช่นเดียวกัน แต่ที่นิยมคือ ใช้ไพรเมอร์เพียงชนิดเดียวและใช้วิธีแบบที่เรียกว่าอาร์เอพีดี คิดค้นขึ้นโดย วิลเลียมส์ และคณะในปี ค.ศ. 1990 โดยใช้ไพรเมอร์ขนาด 10 นิวคลีโอไทด์เพียงชนิดเดียวเพื่อเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ แล้วแยกขนาดของดีเอ็นเอที่ได้โดยการทำอิเล็กโทรโฟรีซิสในเจลอะกาโรส และย้อมแถวดีเอ็นเอด้วยเอธิเดียมโบรไมด์

DAF ใช้ครั้งแรกโดยคณะของ Caetano-Anolles ในปี ค.ศ. 1991 โดยใช้ไพรเมอร์ขนาดสั้นเพียง 5-8 นิวคลีโอไทด์ และใช้โปรแกรมการเพิ่มปริมาณโดยใช้อุณหภูมิ 2 ระดับเท่านั้น แทนที่จะใช้ 3 ระดับแบบที่ใช้กับ PCR ทั่วไป แล้วแยกชิ้นดีเอ็นเอที่ได้โดยทำอิเล็กโทรโฟรีซิในเจลพอลิอะครีลาไมด์ และย้อมด้วยซิลเวอร์ไนเตรท

AP-PCR ทำโดย Welsh และ McClelland ในปี ค.ศ. 1990 โดยใช้ไพรเมอร์ขนาด 20 หรือ มากกว่า 20 นิวคลีโอไทด์ ใช้โปรแกรมการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ 2 โปรแกรม คือ ใช้อุณหภูมิสำหรับ annealing ต่ำในรอบแรกแล้วจึงเพิ่มให้สูงขึ้นอีก 30-40 รอบ ในการทำ PCR ช่วงหลังใส่นิวคลีโอไทด์ที่ติดฉลากด้วยสารกัมมันตรังสีลงไป แล้วจึงแยกขนาดดีเอ็นเอด้วยเจลพอลิอะคลีลาไมด์ตรวจสอบผลโดยทำออโตเรดิโอกราฟ ซึ่งนับเป็นวิธีที่ยุ่งยากที่สุด

หลักการทำ RAPD

วิธี RAPD ของ William และคณะ ใช้ไพรเมอร์ขนาด 10 นิวคลีโอไทด์ ซึ่งจะเข้าไปเกาะกับดีเอ็นเอเป้าหมายในบริเวณที่มีเบสเป็นคู่สมกัน โดยไม่จำเป็นต้องทราบว่าไพรเมอร์จะเข้าไปเกาะกับดีเอ็นเอส่วนใดบนโครโมโซมใด โอกาสที่จะพบลำดับเบสที่เป็นคู่สมกับไพรเมอร์คือ 1 ใน 410 โดยประมาณ ถ้าไพรเมอร์เข้าไปเกาะกับดีเอ็นเอโดยเกิดคู่สมได้ 100 เปอร์เซ็นต์ และนิวคลีโอไทด์แต่ละชนิดมีสัดส่วนเท่า ๆ กันในจีโนม สามารถประมาณค่าของจำนวนแถบดีเอ็นเอที่จะเกิดขึ้นจากไพรเมอร์ 1 ชนิดได้จากสมการ

b = (2,000 x 4-2n) x c

เมื่อ

b คือ จำนวนแถบดีเอ็นเอที่คาดหมายในหนึ่งไพรเมอร์

n คือ ความยาวของไพรเมอร์ คิดแป็นจำนวนนิวคลีโอไทด์

c คือ ค่าขนาดของจีโนมหรือค่า c value

ตัวอย่างเช่น ข้าวโพดมีจีโนมขนาด 6 x109 คู่เบส นำมาทำ RAPD โดยใช้ไพรเมอร์ขนาด 10 นิวคลีโอไทด์ (10-mer) จะได้แถบดีเอ็นเอประมาณ 10.9 แถบ

อย่างไรก็ตาม จากการทดลองของนักวิจัยหลายท่านพบว่าจำนวนแถบดีเอ็นที่เกิดขึ้นไม่ได้ขึ้นกับขนาดของจีโนม พืชที่มีจีโนมขนาดใหญ่อาจเกิดแถบดีเอ็นเอที่น้อยกว่าพืชที่มีจีโนมขนาดเล็กก็ได้ การเกิดแถบดีเอ็นเอเป็นผลมาจากไพรเมอร์เข้าไปเกาะได้หลายบริเวณ ถ้าไพรเมอร์ไปเกาะกับดีเอ็นเอ 2 บริเวณที่อยู่ไม่ไกลกันมาก โดยเกาะกับดีเอ็นเอคนละสายในทิศทางเข้าหากัน (5’ -> 3’) จะสามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอในช่วงดังกล่าวได้ แต่ถ้าไพรเมอร์เกาะกับดีเอ็นเอสายเดียวกันในทิศทางเดียวกัน หรือเกาะกับดีเอ็นเอคนละสายแต่ทิศทางแยกออกจากกันหรือเกาะได้ใน 2 สายที่ห่างไกลกันมาก แม้ทิศทางจะเข้าหากันก็ไม่สามารถจะเกิดผลผลิตได้ ความแตกต่างของแถบ RAPD หรือพอลิมอร์ฟิซึมที่เกิดขึ้นระหว่างแต่ละตัวอย่างอาจจะเกิดจาก

1. มีชิ้นส่วนดีเอ็นเอขนาดใหญ่มาสอดแทรกในระหว่างตำแหน่ง 2 ตำแหน่งที่ไพรเมอร์เกาะ ทำให้ไพรเมอร์ทั้งสองโมเลกุลอยู่ห่างกันเกินกว่าที่จะเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้ จึงไม่เกิดแถบดีเอ็นเอ
2. ชิ้นส่วนดีเอ็นเอส่วนที่เป็นที่เกาะกับไพรเมอร์หายไปหนึ่งตำแหน่งหรือทั้ง 2 ตำแหน่งทำให้ไม่เกิดแถบดีเอ็นเอจากบริเวณดังกล่าว
3. มีการแทนที่หรือเปลี่ยนแปลงเบสบริเวณที่เป็นที่เกาะของไพรเมอร์ทำให้ไพรเมอร์เกาะกับดีเอ็นเอเป้าหมายไม่ได้จึงไม่เกิดแถบดีเอ็นเอ
4. มีชิ้นส่วนดีเอ็นเอขนาดเล็กสอดแทรกเข้ามาหรือหายไป ทำให้ขนาดของแถบดีเอ็นเอที่เกิดขึ้นเปลี่ยนแปลงไป

อย่างไรก็ดี พอลิมอร์ฟิซึมของ RAPD มักเกิดขึ้นในลักษณะการมีและไม่มีแถบดีเอ็นเอที่ตำแหน่งหนึ่ง ๆ มากกว่าการเปลี่ยนขนาดของแถบดีเอ็นเอ เนื่องจากดีเอ็นเอของพืชพบทั้งจากนิวเคลียส คลอโรพลาสต์ และไมโทคอนเดรีย ในการสกัดดีเอ็นเอจากเซลล์ทั้งหมดนำมาวิเคราะห์ RAPD พบว่าแถบดีเอ็นเอบางส่วนประมาณ 5 เปอร์เซ็นต์เกิดจากการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอในส่วนของไมโทคอนเดรีย และน้อยกว่า 5 เปอร์เซ็นต์มาจากดีเอ็นเอในคลอโรพลาสต์ ดังนั้นแถบดีเอ็นเอของเครื่องหมาย RAPD (RAPD marker) ส่วนใหญ่จึงมาจากดีเอ็นเอในนิวเคลียส ซึ่งมีการถ่ายทอดมาจากทั้งฝ่ายพ่อและฝ่ายแม่ แม้ว่าเทคนิค RAPD จะทำได้ง่าย รวดเร็ว และให้ข้อมูลได้มาก แต่ก็มีข้อเสียในเรื่องการทดลองซ้ำ บางครั้งได้ผลที่ต่างจากเดิมเนื่องจาก RAPD มีความไวต่อการเปลี่ยนสภาวะต่าง ๆ จึงต้องระมัดระวังและควบคุมสภาพการทดลองให้คงที่ นอกจากนี้แถบดีเอ็นเอที่เกิดจาก RAPD ยังแสดงการข่ม (dominance) ต่อการไม่เกิดแถบดีเอ็นเอ ซึ่งทำให้ไม่สามารถบอกความแตกต่างระหว่างโฮโมไซโกตและเฮเทอโรไซโกตได้

วิธีปฏิบัติ

เทคนิค RAPD ทำได้ง่ายและรวดเร็ว นับว่าเป็นพื้นฐานที่ดีสำหรับผู้ที่จะเริ่มงานทางด้านดีเอ็นเอ วิธีปฏิบัติเริ่มจากการเก็บตัวอย่างที่ต้องการศึกษา นำมาสกัดดีเอ็นเอ วัดปริมาณดีเอ็นเอที่ได้ ตรวจสอบคุณภาพ และนำมาทำ PCR โดยสุ่มเลือกไพรเมอร์หลายๆ ชนิด เมื่อเลือกได้ไพรเมอร์ที่เหมาะสมแล้ว จึงวิเคราะห์ RAPD จากตัวอย่างและวิเคราะห์ผลที่ได้

การวิเคราะห์ผลของ RAPD

จากแถบดีเอ็นเอที่ได้ สามารถใช้แยกความแตกต่างของสิ่งมีชีวิตแต่ละตัวอย่าง และบอกความสัมพันธ์ทางวิวัฒนาการระหว่างตัวอย่างได้ด้วย โดยการเปรียบเทียบความเหมือนและความแตกต่างของแถบดีเอ็นเอที่เกิดขึ้น โดยตัวอย่างที่พบแถบดีเอ็นเอที่ตำแหน่งหนึ่ง ๆ ให้สัญลักษณ์เป็น "+" หรือให้คะแนนเป็น "1" ส่วนตัวอย่างที่ไม่พบแถบดีเอ็นเอที่ตำแหน่งเดียวกันนั้นให้สัญลักษณ์เป็น "-" หรือให้คะแนนเป็น "0" ในการให้คะแนนแถบดีเอ็นเอเกิดปัญหาได้บ่อยๆ เช่น แถบดีเอ็นเอในบางแถวจางหรือไม่ชัดเจน หรือตำแหน่งอาจคลาดเคลื่อนจากกัน เนื่องจากเจลเกิด smile อันมีสาเหตุจากแถบดีเอ็นเอแถวที่อยู่ด้านนอกเคลื่อนที่ไปช้ากว่าแถบดีเอ็นเอที่อยู่แถวกลาง เป็นต้น ในกรณีดังกล่าวนี้ถ้าแถบดีเอ็นเอในแถวใดไม่ชัดเจน ไม่อาจบอกได้แน่ชัด ให้ตัดแถบดีเอ็นเอดังกล่าวออกไปไม่ต้องนำมาคิด การให้คะแนนหรือตรวจดูแถบดีเอ็นเอนี้อาจดูด้วยสายตาหรือใช้เครื่องอ่านก็ได้ เปรียบเทียบความเหมือนของแถบของดีเอ็นเอที่ได้จากแต่ละคู่โดยใช้ค่า similarity index (S) โดย S จะมีค่าตั้งแต่ 0 ถึง 1 โดย 0 คือ ทั้งสองตัวอย่างไม่มีแถบดีเอ็นเอที่เหมือนกันเลย และ S=1 หมายถึง ทั้งสองตัวอย่างมีแถบดีเอ็นเอเหมือนกันทั้งหมด

อ้างอิง

• สุรินทร์ ปิยะโชคณากุล (2552). เครื่องหมายดีเอ็นเอ จากพื้นฐานสู่การประยุกต์. สำนักพิมพ์ มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์, กรุงเทพฯ.