อโกรแบคทีเรียม

จากวิกิพีเดีย สารานุกรมเสรี
อโกรแบคทีเรียม
การจำแนกชั้นทางวิทยาศาสตร์
อาณาจักร: Bacteria
ไฟลัม: Proteobacteria
ชั้น: Alpha Proteobacteria
อันดับ: Rhizobiales
วงศ์: Rhizobiaceae
สกุล: Agrobacterium
Species

อโกรแบคทีเรียม (อังกฤษ: Agrobacterium) จัดเป็นจุลินทรีย์ประเภทแบคทีเรียแกรมลบอาศัยอยู่ในดิน ถูกค้นพบโดย Nicholas Davidson เป็นแบคทีเรียที่นิยมใช้ในการถ่ายโอนยีนในพืช Agrobacterium tumefaciens จัดเป็นสายพันธุ์ที่นิยมใช้ศึกษาในการถ่ายยีนเข้าสู่พืชโดยนำยีนที่สนใจถ่ายเข้าสู่จีโนมพืชด้วยเทคนิคทางพันธุวิศวกรรม เพื่อใช้ในการปรับปรุงพันธุ์พืช

สายพันธุ์ที่พบ[แก้]

Agrobacterium tumefaciens[แก้]

สายพันธุ์ที่ก่อให้เกิดโรคปุ่มปมมงกุฎ (crown gall)

การเจริญเติบโตที่ผิดปกติเป็นปุ่มปมจากเชื้อ Agrobacterium sp.

Agrobacterium rhisogenes[แก้]

สายพันธุ์ที่ก่อให้เกิดโรครากเจริญผิดปกติ (Hairy root)

Agrobacterium radiobacter[แก้]

เป็นสายพันธุ์ที่รุนแรง

Agrobacterium rubi[แก้]

ก่อให้เกิดโรค Cane gall

Agrobacterium vitis[แก้]

การก่อโรคในพืช[แก้]

A. tumefaciens ก่อให้เกิดโรค crown-gall ในพืชในพืชใบเลี้ยงคู่หลายชนิด โดยพืชที่ได้รับเชื้อแบคทีเรียชนิดนี้จะเกิดปุ่มปมคล้ายมงกุฎ ปุ่มปมนี้จะไปรบกวนระบบทางสรีรวิทยาของพืช เมื่อนำปุ่มปมจากพืชที่เกิดโรคไปทดสอบโดยการเพาะเลี้ยงพบว่ามีการผลิตฮอร์โมนได้เอง โดยยีนจาก A. tumefacienceจะถูกส่งเข้าสู่พืชเมื่อยีนนี้มีการแสดงออกในพืช พืชจะเกิดการแบ่งเซลล์แบบไม่หยุดยั้งก่อให้เกิดปุ่มปมดังกล่าว

กลไกการก่อโรคในพืช[แก้]

1. Transformation คือ T-DNA เข้าสู่จีโนมพืช

2. Tumorigenis คือ เซลล์พืชเกิดการเปลี่ยนโดยการแบ่งเซลล์ตลอดเวลาเป็นจำนวนมากก่อให้เกิดปุ่มปม

องค์ประกอบในจีโนมของAgrobacterium[แก้]

1. Chromosome

2. Plasmid ได้แก่ Tumor inducer plasmid (Ti plasmid), Root inducer plasmid (Ri plasmid)

Ti plasmid[แก้]

มีขนาด 200-800 กิโลเบส ประกอบด้วย

1. T-DNA มีขนาด 10-30 กิโลเบส ขึ้นอยู่กับสายพันธุ์แบคทีเรีย เป็นเพียง10% ของพลาสมิด หลังจากเกิดการบุกรุกโดยแบคทีเรียบโมเลกุลของ T-DNA จะอยู่อย่างถาวรในเซลล์พืชและส่งผ่านไปสู่เซลล์ลูกเป็นส่วนหนึ่งของโครโมโซม T-DNA มียีนประมาณ 8 ยีน มียีนทีกำหนดการสร้างสารต่างๆที่จำเป็นต่อการเจริญเติบโตของแบคทีเรียเอง โดยใช้เอนไซม์และสารตั้งต้นจากพืช ตัวอย่างเช่นยีนที่กำหนดการสร้างโอปีน opaline synthase (nos)ซึ่งแบคทีเรียจะใช้เป็นอาหารดังนั้นการที่ A. tumefaciensถ่ายยีนเข้าสู่พืชมีวัตถุประสงค์คือต้องการอาหารจากพืชเพื่อประโยชน์ของแบคทีเรียเอง นอกจากนี้ยังประกอบด้วยยีนtraรวมทั้งยีนที่กำหนดให้แบคทีเรียสามารถใช้สารบางชนิดเป็นแหล่งพลังงานได้ เช่น arginine catabolism ,nopaline catabolism , octopine catabolism นอกจากนี้ยังมียีนสร้างฮอร์โมนพวกออกซินและไซโตไคนินอีกด้วย ทำให้พืชที่ได้รับ T-DNA มีการเจริญเติบโตเร็วไม่จำกัดซึ่งแสดงออกในเซลล์พืชเมื่อบุกรุกเข้าไปในเซลล์พืชทำให้เกิด tumor (เนื้องอกเป็นปุ่มปมที่เรียก crown gall)ในพืชใบเลี้ยงคู่หลายชนิด และสามารถตรวจสอบพืชที่ได้รับพืชที่ได้รับยีนนี้โดยพิจารณาจากปุ่มปมที่เกิดขึ้นในเซลล์ที่ได้รับยีนนี้ จากนั้น T-DNA จะเข้าไปรวมกับโครโมโซมของพืช

2. Virulence genes หรือvir genes มีลักษณะเป็นกลุ่มยีนที่ทำงานร่วมกันโดยใช้โปรโมเตอร์ชนิดเดียวกัน เรียกว่า โอเปอรอน (operon) โดยvir genesมีหน้าที่ส่ง T-DNA เข้าสู่จีโนมพืช vir genesประกอบด้วย

  • VirA/VirG เป็นระบบที่ทำหน้าที่ควบคุม ได้แก่

VirA protein มีหน้าที่สังเคราะห์หมู่ฟอสเฟตแก่ VirA เอง และสังเคราะห์หมู่ฟอสเฟตให้แก่ VirG โดย VirA จะทำการกระตุ้นการทำงานของ VirG เมื่อVirG ทำงานก็จะกระตุ้นการทำงานของ Virอื่นๆต่อไป

  • VirD1/VirD2 ทำหน้าที่ตัดบริเวณส่วน T-DNA บริเวณ Right border,Left border เพื่อให้ได้ T-DNA สายเดี่ยวจากสายคู่เพื่อที่จะได้เข้าสู่เซลล์พืชแบบ single strand T-DNA
  • VirE2 ทำหน้าที่ห่อหุ้ม T-DNA สายเดี่ยวเพื่อป้องกันไม่ให้โดนทำลาย โดยสร้างส่วนห่อหุ้มเรียกว่า T-complex

3. Octopine catabolism ทำหน้าที่สร้างแหล่งพลังงานประเภทสารประกอบไนโตรเจนให้แก่ Agrobacterium

4. Conjugation transfer gene

5. Ori เป็นบริเวณที่เริ่มการจำลองตัว

Ri plasmid[แก้]

มีความสนใจในการพัฒนาพืชที่ถูกโคลนด้วยพาหะที่มีพื้นฐานมาจากพลาสมิด Ri ของA. rhizogenes พลาสมิด Riและ Ti เหมือนกันมากแต่ที่ต่างกันคือการถ่ายทอดพลาสมิด Ri ไปสู่พืชไม่ทำให้เกิดปุ่มปมแต่จะทำให้เกิดปุ่มปมแต่จะทำให้เกิดรากฝอยขึ้นแทน มีความเป็นไปได้ในการเลี้ยงรากที่ได้รับการถ่ายยีนให้มีปริมาณมากในอาหารเหลวเพื่อที่จะนำไปสกัดโปรตีนที่ผลิตจากยีนที่ต้องการในปริมาณสูงได้

กลไกการถ่าย T-DNA เข้าสู่พืช[แก้]

A: Agrobacterium tumefaciens
B: Agrobacterium genome
C: Ti Plasmid  : a: T-DNA , b: Vir genes , c: Replication origin , d: Opines catabolism genes
D: Plant cell
E: Mitochondria
F: Chloroplast
G: Nucleus

1. Bacterial colonization แบคทีเรีย Agrobacterium จะมาเกาะรวมกันบริเวณขอบเซลล์พืช ที่บริเวณพื้นผิวเซลล์พืชมีสารโพลิแซกคาไรด์ซึ่งมีสำคัญในการยึดเกาะของแบคทีเรีย

2. Induction of bacterial virulence system เมื่อพืชเกิดบาดแผลจะปล่อยสารออกมาจากบาดแผล เช่น กรด ,สารฟีโนลิก,สารอะซิโตไซริงโกน โดยสารเหล่านี้จะไปกระตุ้น Periplasmic domain ที่เป็นตัวรับสัญาณของ VirA และส่วน TM2 ที่ทำหน้าที่ผลิตเอนไซม์ kinase ในVirA VirA protein จะทำหน้าที่สังเคราะห์หมู่ฟอสเฟตแก่ VirA เอง และสังเคราะห์หมู่ฟอสเฟตให้แก่ VirG โดย VirA จะทำการกระตุ้นการทำงานของ VirG เมื่อVirG ทำงานก็จะกระตุ้นการทำงานของ Virอื่นๆต่อไป

3. Generation of T-DNA transfer complex การสร้าง T-DNA ให้มีความซับซ้อนขึ้นเพื่อป้องกันการถูกทำลาย โดย VirD1/VirD2 ซึ่งเป็นเอนไซม์เอนโดนิวคลีเอสจะตัดพันธะฟอสโฟไดเอสเตอร์ที่ตำแหน่ง Right border(RB),Left border(LB)ที่ขนาบด้านขวาและซ้ายของ T-DNA ตามลำดับ เกิดเป็น T-DNA สายเดี่ยวจากสายคู่เพื่อที่จะได้เข้าสู่เซลล์พืชแบบ single strand T-DNA จากนั้น VirE2 ทำหน้าที่ห่อหุ้ม T-DNA สายเดี่ยว เพื่อป้องกันไม่ให้โดนทำลาย เป็นโครงสร้าง เรียกว่า T-complex ทั้ง VirD2และ VirE2 จะทำงานร่วมกันโดยรับสัญญาณเพื่อนำ T-DNA เข้าไปสู่นิวเคลียสของพืช

4. T-DNA transfer T-DNA ถูกย้ายสู่พืช

5. Integration of T-DNA into plant genome การขนย้าย T-complex จากAgrobacterium เข้าสู่จีโนมพืช VirD2และ VirE2 จะทำงานร่วมกันโดยรับสัญญาณเพื่อนำ T-DNA เข้าไปสู่นิวเคลียสของพืช โดยเกิดการแทรกแบบสุ่มชนิด Nonspecific recombination (Illegimate)


ข้อจำกัดของการโคลนด้วยพลาสมิด A. tumefaciens[แก้]

ธรรมชาติของA. tumefaciensและA. rhizogenes จะบุกรุกเฉพาะพืชใบเลี้ยงคู่เท่านั้นส่วนพืชใบเลี้ยงเดี่ยวไม่ใช่เจ้าบ้าน และปัญหาอีกประการคือการพัฒนาเป็นต้นจากโปรโทพลาสต์หรือจากเซลล์เพาะเลี้ยงทำได้ยากและจำกัดในพืชบางชนิด ความยากง่ายของการเจริญเป็นต้นขึ้นอยู่กับชนิดของพืชและที่พัฒนาได้ยากก็คือพืชใบเลี้ยงเดี่ยว